Для лечения многих болезней необходимы различные биологически активные вещества. При выделении их из тканей человека возникает опасность загрязнения полученного материала различными вирусами (гепатита В, иммунодефицита человека и др.). Кроме того, эти вещества производятся в небольших количествах и являются дорогостоящими. Биологически активные вещества животного происхождения низкоэффективны из-за несовместимости с иммунной системой больного человека. Только развитие новой отрасли генной инженерии помогло обеспечить получение чистых биологически активных веществ в больших количествах по более низкой цене.

Генная инженерия - это создание гибридных, рекомбинантных молекул ДНК, а стало быть, и организмов с новыми признаками. Для этого необходимо выделить ген из какого-либо организма или искусственно синтезировать его, клонировать (размножить) и перенести в другой организм.

Инструментами генной инженерии являются ферменты: рестриктазы (разрезающие молекулу ДНК) и лигазы (сшивающие ее). В качестве векторов-переносчиков используются вирусы.

С помощью генной инженерии созданы штаммы кишечных палочек, в которые встроены гены человеческого инсулина (необходимого для лечения сахарного диабета), интерферона (противовирусного препарата), соматотропина (гормона роста).

С помощью генной инженерии созданы дрожжевые клетки, продуцирующие человеческий инсулин. Биосинтетический метод производства человеческого инсулина с помощью дрожжевых клеток широко используется в фармацевтическом производстве (в Дании, Югославии, США, Германии и других странах).

В настоящее время ученые разных стран работают над получением с помощью генной инженерии ряда других необходимых биологически активных веществ, вакцины против гепатита В, активатора профибринолизина (противосвертывающий препарат), интерлейкина-2 (иммуномодулятор) и др.

В клетки животных чужеродные гены вводят в виде отдельных молекул ДНК или в составе векторов-вирусов, способных вносить в геном клетки чужую ДНК. Обычно применяют два метода:

1) ДНК добавляют в среду инкубации клеток;

2) производят микроинъекции ДНК непосредственно в ядро (что более эффективно).

Первоочередными задачами генной инженерии у человека являются создание банков генов человека для их изучения и поиск путей генотерапии, то есть замены мутантных генов нормальными аллелями.

Клеточная инженерия - это метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации или реконструкции. При гибридизации искусственно объединяются целые клетки (иногда далеких видов) с образованием гибридной клетки. Клеточная реконструкция - это создание жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток (ядра, цитоплазмы, хромосом и др.).

Изучение гибридных клеток позволяет решать многие проблемы биологии и медицины. Так, например, биотехнология использует гибридомы. Гибридома - это клеточный гибрид, получаемый слиянием нормального лимфоцита и опухолевой клетки. Она обладает способностью к синтезу моноклональных (однородных) антител желаемой специфичности (свойство лимфоцита) и к неограниченному росту в искусственной среде (свойство опухолевой клетки).

Биотехнология - это производство продуктов и материалов, необходимых для человека, с помощью биологических объектов.

Термин «биотехнология» получил распространение в середине 70-х годов XX в., хотя отдельные отрасли биотехнологии известны давно и основаны на применении различных микроорганизмов: хлебопечение, виноделие, пивоварение, сыроварение. Достижения генетики создали большие дополнительные возможности для развития биотехнологии.

В середине XX в. и во второй его половине, используя индуцированный мутагенез, были получены антибиотики (пенициллин, стрептомицин, эритромицин и др.) - с помощью микробов; фермент амилаза - с помощью сенной палочки, аминокислоты - с помощью кишечной палочки; молочная кислота - с помощью молочно-кислых бактерий; лимонная кислота - с помощью аспергилловой плесени; витамины группы В - с помощью дрожжей.

В последние десятилетия в результате успехов, достигнутых генной инженерией, происходит скачок в биотехнологии - развивается микробиологическая промышленность (микробиологическая индустрия), которая позволяет в промышленных условиях с помощью кишечной палочки или дрожжей получать человеческий инсулин, интерферон, соматотропин и другие вещества.

С давних пор человек мечтал о том, чтобы разводимые им животные были больше, выносливее и продуктивнее. Чтобы выращиваемые им сельскохозяйственные культуры вызревали в кратчайшие сроки, не поражались вредителями и болезнями, росли даже в условиях пониженных температур окружающего воздуха и отсутствия регулярных дождей.

В какой-то мере все эти планы удавалось претворить в жизнь благодаря селекции, но процесс этот весьма длительный, да и гарантии полного успеха дать никто не сможет. Кроме того, этот метод никак не поможет совместить в одном организме черты сразу нескольких видов. Конечно, если они могут скрещиваться естественным путем, то это возможно, но в прочих случаях о требуемых наследственных качествах можно только мечтать.

Основные технологии

Основным методом достижения таких результатов является клеточная инженерия. Наиболее детально все ее приемы отработаны на некоторых микроорганизмах. Вообще, дальнейшие возможности и перспективы данного направления попросту необъятны. На данный момент ведутся углубленные разработки по выделению отдельных генов, которые и можно встраивать в организм. Проще говоря, можно будет создавать домашних животных и растения, которые бы обладали строго определенным набором признаков и имели требуемый внешний вид.

Не стоит забывать и о том, что клеточная инженерия микроорганизмов сделала реальным получение «многофункциональных» бактерий, которые, к примеру, могут биологическим путем разлагать полиэтилен. Кроме того, модифицированные бактерии - идеальный материал для производства вакцин. Они вполне могут быть абсолютно безопасными (что позволяет применять «живые» препараты) из-за полностью отсутствующей вирулентности, но обладать всем набором антигенов своих «диких» предков.

Наконец, именно клеточная инженерия растений позволила вывести знаменитые квадратные арбузы и лимоны без косточек. Именно ей мы обязаны появлению картофеля, который не поедают личинки и взрослые особи колорадского жука. Именно благодаря генетическим исследованиям появилась пшеница, которая с легкостью дает отличный урожай на засоленных (!) почвах!

Методы клеточной инженерии

Всем растительным клеткам присуще свойство тотипотентности (это когда отдельная клетка может развиться в целый организм). В сельском хозяйстве это дает неограниченные перспективы в экспериментах по выведению новых видов полезных человеку культур. Весьма перспективна клеточная инженерия в животноводстве. В настоящее время ученые имеют громадный опыт по накоплению и хранению соматических клеток разнообразных пород животных in vitro. Особенно это касается хранения материала в условиях низких температур.

Кстати, а какие существуют методы клеточной инженерии животных? Давайте их обсудим.

Разделение эмбрионов на ранних стадиях

На сегодняшний день особенно перспективен метод разделения ранних эмбрионов. Первый толчок этому направлению дала начавшая развиваться трансплантология, методы которой позволили сохранять большое количество полученных эмбрионов. Вообще, первый удачный опыт по разделению зародышевого материала на стадии 2—8 был проведен Виллардом (в английском Кембридже). Недостаток такого метода в его трудоемкости, из-за чего данная операция может быть выполнена только в условиях хорошо оснащенного медицинского учреждения.

Проще говоря, это чрезвычайно сложная биотехнология. Клеточная инженерия в наше время использует куда более простые методы.

Позднее разделение зародышей

Так, ученые начали манипулировать зародышевым материалом только на более поздних стадиях (морула, бласто-циста). Сущность метода состоит в том, что сперва вскрывается прозрачная зона (pellucida), после чего эмбрион аккуратно разделяется надвое. Одна половинка остается на прежнем месте, в то время как вторую часть переносят в заранее подготовленную зону.

Даже несколько лет назад выживаемость эмбрионов при использовании этой методики достигала 50—60%, тогда как на сегодняшний день этот показатель приближается уже к 80%. Основной прикладной эффект - значительное увеличение количества телят, получаемых от одного производителя. Неудивительно, что клеточная инженерия животных - отрасль, которая не испытывает недостатка в финансировании.

Первыми в этих опытах были американские ученые. Именно они сделали вывод, что если лишить эмбрион прозрачной оболочки, то он выживает не более чем в 15% случаев, но если слой пеллюцида сохранить, то выживаемость сразу увеличивается до 35% случаев. Наиболее оптимальные результаты получаются в том случае, если у каждой половинки разделенного эмбриона есть прозрачная оболочка и каждую часть вводят в отдельный рог матки: в современных условиях выживает до 75% эмбрионов.

Но для каких целей используется клеточная инженерия на практике? Какие результаты получают с ее помощью?

Значение клеточной инженерии в племенном деле

На сегодняшний день эта методика все более активно начинает использоваться в международном племенном деле. Сравнительно недавно была успешно опробована методика получения и внедрения эмбрионов у свиней. Исследователи считают, что клеточная инженерия может позволить увеличить количество потомков одного животного минимум на 30—35%. Но не стоит забывать и о возможности получения генетических копий.

Такие животные едва ли не на вес золота для тех ученых, которые изучают взаимодействие окружающей среды и генотипа. Дело в том, что наличие двух совершенно одинаковых особей позволяет свести к минимуму влияние внутренних факторов при изучении влияния внешней среды на организм. Кроме того, можно производить забой одного животного из пары в том случае, если для исследования требуются данные о внутреннем состоянии организма.

Все эти разработки - основные методы клеточной инженерии. Но мы забыли рассказать о важнейшем направлении этой отрасли наук, связанном с искусственной регуляцией пола сельскохозяйственных животных. Пора исправить этот недочет.

Методы регуляции пола

Наверняка никто не удивится, узнав о невероятной важности разработок в области искусственной регуляции пола у сельскохозяйственных животных. В настоящее время ученые не могут регулировать численность животных одного пола, да и с узнаванием половой принадлежности особи на ранних этапах ее развития существуют большие проблемы. Пока что прогресс в деле искусственной регуляции этого показателя достигнут лишь очень незначительный: даже клеточная инженерия и клонирование не позволяют до конца решить эту проблему.

Конечно же, в идеале стоило бы попросту разделять спермии, которые несут Х- и У-хромосомы. Именно в этом направлении и должны развиваться исследования. Другой подход (который куда проще, а потому используется) состоит в том, чтобы извлекать ранние эмбрионы из репродуктивной системы самок, определять их пол, а затем производить их трансплантацию.

Но как ко всему этому относятся методы клеточной инженерии? Все достаточно просто.

Все дело в цитологическом методе, при помощи которого определяют тип эмбриона XX или XY. Делается это посредством изучения хроматина или же половых хромосом. В последние годы также выяснено, что выяснить пол можно, изучив специфические антитела, которые у самок и самцов совершенно разные. Есть также мнения некоторых ученых, что установить гендерную принадлежность можно, изучив активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. Впрочем, в настоящее время наиболее эффективны цито-логический и иммунологический (изучение антител) методы.

Генная инженерия

В названии данной статьи неслучайно используется словосочетание "генная и клеточная инженерия". Какими бы эффективными ни были методы коррекции клеточного материала, работа непосредственно с генами всегда будет намного более эффективной.

В настоящее время именно генетические методы постепенно завоевывают лидирующую роль в животноводстве и растениеводстве всего мира. Благодаря им селекционная работа вышла на принципиально иной уровень: отныне ученые могут не просто предполагать, какими именно качествами будет обладать создаваемая ими особь, но знать это наверняка.

Нужно сразу заметить, что все не так уж и хорошо. Имеются некоторые ограничения. Дело в том, что к генетическим манипуляциям допускается только генетический материал быков, которые могут улучшать свое потомство (улучшатели). Проблема только в том, что таких животных на сегодняшний день чрезвычайно мало. Кроме того, программы, направленные на искоренение того же мастита, пока что видимых результатов не дают. Проще говоря, генная и клеточная инженерия - далеко не панацея.

Сами же методы инженерии стали складываться в единую систему только с 50-х годов прошлого века. Так, одной из основных работ, которые и положили начало данной отрасли науки, стали опыты по пересадке клеточных ядер по методу Бригса и Кинга. Сперва удачно осуществить данную операцию получалось исключительно на лягушках. В настоящее время проводятся удачные опыты по пересадке генетического материала даже у мышей и более крупных млекопитающих.

Сравнительно недавно учеными был создан метод переноса ядра после слияния кариопластов. Кроме того, методы генной и клеточной инженерии уже сейчас позволяют создавать химерические организмы на основе различных видов мекопитающих.

Гарднером вскоре был разработан принципиально новый метод, при котором производится имплантация бластомеров в бластоцисты реципиента. Бутлером данная методика была успешно отработана на лабораторных мышах. Именно на основании данных разработок впервые были получены химеры на основе организма овец.

Все описанные выше работы постепенно готовили мировую сельскохозяйственную науку к широкому внедрению методов генной инженерии. Наиболее распространенным методом на сегодняшний день является перенос генного материала в культивируемые клетки с последующим их внесением в бластоцисту.

Но перед тем как мы разберемся с некоторыми аспектами этой технологии, стоит ответить на важный вопрос. Точнее, обсудить отличие генной инженерии от клеточной. В общем-то, здесь все достаточно просто: если в первом случае ученые оперируют непосредственно генетическим материалом, то при использовании «клеточных» методов для работы берутся целые органоиды и участки клеток, которые имплантируются в материал реципиента.

Развернутое определение

Так в чем состоит суть генной инженерии? В середине 70-х годов прошлого века ученые сделали сенсационное открытие. Они выяснили, что некоторые микробные ферменты способны разрезать молекулу ДНК в необходимом месте. Проще говоря, появилась уникальная возможность получать генетический материал со строго заданными свойствами.

Наконец-то исследователи смогли с высочайшей точностью идентифицировать определенные гены, а также клонировать их в случае необходимости. Какими принципами руководствуются ученые в своей работе? В общем-то, их всего два:

• Ген должен иметь какую-то четкую характеристику, которую и предстоит детектировать.
• Выделенный генетический материал требуется прикрепить к переносчику (вирусу, к примеру), который и произведет его трансплантацию.

Проще говоря, выделенный ген из организма донора нужно перенести в организм реципиента, для которого он является чужим. Главное в работе исследователей - не просто добиться его приживления, но и создать такие условия, при которых он будет нормально реплицироваться.

Работа с зиготой

Впрочем, в последние годы не меньшее распространение получила методика, при которой чужеродные гены инъецируют в пронуклеус зиготы животных. Впервые этот способ был апробирован на ооцитах озерных лягушек: сперва в них вводилась определенная ДНК, причем учеными сразу были отмечены интеграция и транскрипция. В 1981 году впервые был проведен интереснейший эксперимент, в ходе которого ген гаммаглобулина кролика был внесен в зиготу мыши.

Ген при этом имел вид длинного геномного тандема, содержащего стабильные участки. Любопытно, но правильно транскрибирова-лись они только при том условии, если в них совершенно не было плазмидных компонентов. Проявление генов, которые были встроены с использованием этого метода, было подробнейшим образом изучено на лабораторных мышах.

За один год до экспериментов с зиготой мыши, в 1980 году, в пронуклеус все той же мышиной зиготы поместили плазмиду pBR322, в которой содержались фрагменты вирусов SK40 и HSV. В результате ДНК вируса была найдена у трех мышей из 78 особей, которые участвовали в эксперименте. Как ни странно, но при инъекции гена гаммаглобулина человека его интеграция наблюдалась уже у пяти мышей из 33 особей (более 15%). Этот опыт уже тогда доказал, что создание химерических организмов, которые бы сочетали в себе черты сразу нескольких видов, вполне реально.

Бринстер и его последователи с учениками произвели трансплантацию в пронуклеусы зигот мышей специально подготовленной конструкции, в состав которой входил металлотионеин мыши, а также ген тимидинкиназы. В этом случае полная интеграция была отмечена уже у 17% лабораторных животных.

Основные выводы

В настоящее время генная инженерия наконец-то стала перспективной, обсуждаемой отраслью науки. Об этом знают практически все. Но в чем же состоят задачи клеточной инженерии и работы с генетическим материалом? О, они весьма разнообразны.

Во-первых, перед учеными всего мира стоит задача усмирения, снижения голода на всей планете. Методы генной и клеточной инженерии делают вполне реальным создание таких сортов растений и видов животных, продуктивность которых будет в десятки раз превышать таковую у их диких предков.

Во-вторых, эта научная отрасль, быть может, окажется способна победить проблемы преждевременного старения и прочих генетических заболеваний, от которых на сегодняшний день не существует ни одного лекарства. Наконец, именно генная инженерия когда-нибудь наверняка позволит в значительной степени продлевать жизнь!

Специалисты говорят, что именно методы генной инженерии уже в ближайшем будущем позволят не только диагностировать на предельно ранних сроках беременности генетические болезни (синдром Дауна, к примеру), но и эффективно их лечить!

Генная инженерия. Развитие молекулярной биологии в конце XX в. привело к ряду открытий, имеющих важное практическое значение. К числу таких достижений принадлежит создание методов синтеза и выделения генов, положивших начало генной инженерии.

Мы знаем уже, что гены представляют собой участки ДНК, которые кодируют ферменты, белковые гормоны, защитные, транспортные и иные белки. Многие из этих белков, синтезируемых в клетках бактерий, животных или растений, представляют большую практическую ценность для медицины, сельского хозяйства, промышленности. Однако чаще всего они производятся клетками в малых количествах, и поэтому широкое использование их затруднено или невозможно. Так, важное значение для медицины имеет производство белкового гормона роста. Он вырабатывается гипофизом и контролирует рост человеческого тела, его недостаток приводит к карликовости. Введение этого гормона детям, страдающим карликовостью, обеспечивает им нормальное развитие.

Если бы мы научились вводить в клетки растений новые гены, кодирующие полноценные белки, то такие растения не отличались бы по пищевой ценности от продуктов животного происхождения. Недостаток животных продуктов (молока, яиц, мяса, рыбы), которые содержат все необходимые аминокислоты, испытывает более половины населения Земли.

В клетках некоторых бактерий есть белки, которые способны с высокой эффективностью превращать световую энергию Солнца в электрическую энергию. Если бы мы могли производить такие белки в больших количествах, то на их основе можно было бы создать промышленные установки для получения дешевой электроэнергии. Эти и многие другие задачи позволяет решать генная инженерия.

Сегодня известно несколько способов получения генов, кодирующих необходимые белки. Так, разработаны методы химического синтеза молекул ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов. Более того, уже синтезирован таким способом ряд генов, кодирующих белковые гормоны и интерфероны - белки, защищающие человека и животных от вирусов.

Наконец, необходимые гены можно не синтезировать, а выделять готовыми из множества генов. Разработана специальная техника выделения одиночных нужных генов из всей массы ДНК, где их имеется несколько десятков тысяч.

Синтезированный или выделенный ген можно встроить в самокопирующуюся ДНК бактериофага и ввести в бактериальную клетку. Такие бактерии начинают синтезировать человеческий или животный гормон, нужный фермент или интерферон. Этим способом в бактерию можно ввести программу синтеза любого белка человека, животного или растения.

Нужный ген человека или другого организма можно ввести в бактерию, не вырезая его из ДНК. На рисунке 28 показана одна из схем получения гена путем обратной транскрипции, встраивания его в бактериальную плазмиду и наработки бактерией «чужого» белка. На первом этапе из клеток выделяют иРНК, считанную с выбранного гена. Затем на ней, как на матрице, синтезируют нить комплементарной ей ДНК (кДНК). Это осуществляют с помощью фермента обратной транскриптазы, нуждающейся для начала синтеза в искусственной затравке - коротком фрагменте ДНК, комплементарном матрице. Получается гибридная ДНК-РНК-молекула. После удаления РНК из этой молекулы на оставшейся одноцепочечной ДНК осуществляют синтез второй нити. В результате возникает полноценная молекула ДНК. Используя специальные ферменты, ее встраивают в бактериальную плазмиду - кольцевую внехромосомную молекулу ДНК, выполняющую роль переносчика нужного гена. Такой рекомбинантной, т. е. содержащей чужеродную информацию, плазмидой «заражают» бактериальную клетку. В ней плазмида реплицируется, и перенесенный ген другого микроорганизма, человека, животного или растения начинает работать. В бактериальной клетке накапливается необходимый белок, остается лишь выделить его из бактериальной массы. Таких бактерий размножают в промышленных масштабах и получают необходимый белок в больших количествах. Все эти технологические приемы основаны на успехах в познании физико-химических основ жизни. Решение практических задач с помощью описанных методов молекулярной биологии и генетики и составляет сущность генной инженерии.

Puc. 28. Схема получения гена требуемого белка

Клеточная инженерия. Биотехнология. К генной инженерии примыкает клеточная инженерия, основанная на успехах клеточной биологии. Ученые научились соединять клетки разных видов растений, объединяя их генетические программы. Такие клетки приобретают новые свойства, становятся производителями ценных лекарственных или пищевых веществ, витаминов. Из таких гибридных клеток можно выращивать целые растения с новыми свойствами, объединяющими признаки растений разных видов, которые обычно не скрещиваются между собой. В зародыши клеток животных научились вводить новые гены и получать животных с новыми наследуемыми свойствами.

Не за горами исправление наследственной программы, полученной ребенком от родителей, в том случае, если она содержит «испорченные» гены. Станет возможным введение в зародыш на ранних этапах его развития нормальных генов и тем самым избавление людей от страданий, вызываемых генетическими болезнями.

Человечество вступило в новую эпоху конструирования генетических программ, и на этой основе создаются новые формы микроорганизмов, растений, животных. В технике начинается широкое использование физико-химических принципов работы живой клетки, ее энергетических устройств для решения практических задач и создания промышленных технологий. Возникло перспективное направление в биологии - биотехнология.

1. Какие задачи стоят перед клеточной и генной инженерией?
2. Какова последовательность этапов получения рекомбинантной плазмиды?
3. Каковы перспективы генной и клеточной инженерии?

6.1 Генетическаяинженерия, принципы, возможности. Областиприменениябиологическихагентов, полученныхметодамигенетическойинженерии

При оптимизации любого биотехнологического процесса, протекающего с участием живых организмов, основные усилия обычно направлены на улучшение их генетических свойств. Традиционно для этих целей использовали мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов. Сегодня в этой области произошли громадные перемены. В настоящее время разрабатываются и применяются принципиально новые методы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК. Модификация генетического материала осуществляется разными методами: в живом организме (in vivo) и вне его (in vitro), соответственно, это два направления – клеточная инжене-

рия и генетическая инженерия.

С помощью этих методов возможно получение новых высокопродуктивных продуцентов белков и пептидов человека, антигенов, вирусов и др. Развитие генетической и клеточной инженерии приводит к тому, что биотехнологическая промышленность все шире и шире завоевывает новые области производства. Фундаментом для возникновения новейших методов биотехнологии послужили открытия в генетике, молекулярной биологии, генетической энзимологии, вирусологии, микробиологии и других дисциплинах.

Быстрое внедрение новейших фундаментальных достижений в практику и существенное влияние последних на уровень теоретических исследований, свойственные биотехнологии, наиболее наглядно проявляются на примере развития генетической инженерии.

Важнейшим этапом для развития биотехнологии было выделение в середине текущего столетия молекулярной биологии в самостоятельную дисциплину. Возникновение молекулярной биологии стало возможным благодаря взаимодействию генетики, физики, химии, биологии, математики и др. Э. Чаргофф и З. Д. Хочкис, исследуя молекулярные соотношения нуклеотидных оснований в ДНК (аденин, гуанин, цитозин, тимин) показали, что у различных организмов они одинаковы. Это открытие сыграло ключевую роль в установлении структуры ДНК. Большую роль в расшифровке структуры ДНК сыграл прогресс в области генетики бактерий и бактериофагов. Было установлено (А. Херши, М. Чейз, Дж. Ледерберг, Н. Циндер), что трансдук-

ция (перенос генетического материала) может осуществляться с помощью бактериофага, а фаговой ДНК может принадлежать роль носителя наследственности. Б. Хейсом были выяснены также закономерности полового процесса у бактерий (конъюгация), при котором из донорских клеток, имеющих F-фактор (фертильность), генетический материал переносится в реципи-

ентные клетки. Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили комплиментарную модель строения ДНК и механизм ее репликации; было раскрыто уникальное свойство ДНК – способность самовоспроизведения (репликация).

На базе молекулярной биологии и генетики микроорганизмов к началу 60-х гг. сформировалась молекулярная генетика. Г. Гамов в 1954 году выдвинул гипотезу о том, что каждый кодон (последовательность нуклеотидов, кодирующая одну аминокислоту) должен состоять из трех нуклеотидов. В 1961 году было подтверждено экспериментально, что первичная структура белка закодирована в ДНК в виде последовательности нуклеотидных триплетов (кодонов), каждая из которых соответствует одной из 20 аминокислот. К 1966 году удалось получить данные о строении генетического кода.

Следующим был вопрос о том, как переносится информация с ДНК, находящейся в ядре, в цитоплазму, где реализуется синтез белка на рибосомах. Было установлено, что последовательность триплетных кодонов, хранящаяся в ДНК, транскрибируется (переписывается) в недолговечные молекулы ин-

формационной РНК (иРНК). Данный этап ДНК → иРНК был назван транс-

крипцией, а этап иРНК → белок – трансляцией. Перенос аминокислоты и определение ее местонахождения в синтезирующейся белковой молекуле осуществляет транспортная РНК (тРНК). На ДНК, как на матрице, синтезируется РНК, а на РНК – белок. У некоторых вирусов отсутствует первое звено, и РНК служит для них материалом наследственности.

Механизм контроля генной активности долгое время оставался неизвестным. Большое значение имели работы Ф. Жакоба и Ж. Моно, показавшие, что у бактерий есть структурные гены , дающие информацию о синтезе определенных белков и регуляторные гены, которые осуществляют включение или выключение отдельных генов или их блоков. Далее выяснилось, что регуляция генов по этому принципу имеет место и у других организмов. Существуют также иные механизмы регуляции.

Следующим важным шагом было проведение работ по расшифровке нуклеотидных последовательностей (секвенирование) , которое дает информацию о первичной структуре участка генома, выполняющего определенные функции. Структура и функции приобрели общее молекулярно-биологическое выражение, его суть заключается в том, что функциональные состояния выражают структурные изменения макромолекул и ассоциаций.

От изучения закономерностей функционирования генетического материала в клетке вскоре исследователи перешли к генетическим манипуляциям. Возникла новая экспериментальная технология, заключающаяся во введении в клетки чужеродных генов. Названия «генетическая (или генная) инженерия» или «работа с рекомбинантными ДНК» эквивалентны. Суть этой техно-

логии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro с последую-

щим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку.

В 1972 году Берг с сотрудниками создали первую рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из фрагмента ДНК вируса ОВ40 и бактериофага

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.1 Генетическая инженерия, принципы, возможности. Области применения биологич. агентов, полученных методами генетич. инженерии

λ dvgal с галактозным опероном E. coli . Инструментом для генетического конструирования стали две группы ферментов – рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы) и лигазы . Первые необходимы для получения од-

нородных фрагментов ДНК, вторые – для их соединения. Рестриктазы и лигазы в совокупности с другими ферментами (нуклеазами, обратной транскриптазой, ДНК-полимеразой и др.) обеспечивают проведение всех генноинженерных манипуляций.

Плазмида E.coli расщепляется рестриктазой в обеих частях ДНК с образованием на концах неспаренных нуклеотидов (ТТАА или ААТТ). Ген выщеплен с помощью этой же рестриктазы с образованием на концах, комплиментарных плазмиде, последовательностей (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают с помощью лигазы. Гибридную плазмиду вводят в E. coli , которая при размножении образует клон, все клетки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной клетке и индуцирует в ней синтез белка.

Техника генетического конструирования in vitro включает несколько последовательных процедур (слайд):

- получение нужного гена;

- встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);

- введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;

- идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.

Получение генов. Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.

Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые тупые концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие.

Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.1 Генетическая инженерия, принципы, возможности. Области применения биологич. агентов, полученных методами генетич. инженерии

точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в

гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связеймежду нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие последовательности одноцепочечной ДНК. На слайде показана схема такой машины, сконструированной канадской фирмой «Био лоджикэлс». Нужная последовательность оснований вводится на клавишный пульт управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помощью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нуклеотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка наполнена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В данном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со скоростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.

Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК

(мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присутствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК ). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния. Метод с большим успехом применен для получения в 1979 году гена гормона роста человека (соматотропина).

Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена.

Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК. При обычном введении в

бактериальную клетку ДНК подвергается ферментативной атаке, в результате которой разрушается. Чтобы этого не происходило, используют векторные молекулы ДНК, способные при введении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – реплицироваться. Вектор также несет в своем составе генетический признак, необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устойчивости к антибиотикам.

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.1 Генетическая инженерия, принципы, возможности. Области применения биологич. агентов, полученных методами генетич. инженерии

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro с изолированными ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции, которые расщепляют вектор в одном участке, превращая его из кольцевой формы в линейную с образованием липких концов, комплиментарных концам вводимой ДНК. Комплиментарные концы вектора и вводимого гена сшиваются лигазой. Полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы замыкают с образованием кольцевой молекулы.

В качестве векторов используют плазмиды и вирусы. Вирусы транспортируются из клетки в клетку, за короткое время способны быстро заразить весь организм. Важная проблема при их использовании – аттеньюация (ослабление патогенности для хозяина); поэтому не очевидно, что зараженные вирусом клетки выживут и смогут передавать потомству измененную генетическую программу. Наиболее распространенными векторами являются многокопийные плазмиды с молекулярной массой 3–10 кб. Первые плазмиды были выделены из бактерий, впоследствии их стали конструировать методами генной инженерии.

Использование векторов общего назначения методически – несложная задача, не требующая специального оборудования. Наиболее используемыми плазмидными векторами для клонирования служат плазмиды E. coli (pBR322, pBR325, pACYC117, pACYC 184), а также сконструированные на основе плазмиды CoIEI. Современные плазмидные векторы в присутствии хлорамфеникола способны к репликации, независимо от деления хромосомы, количество копий плазмид при этом может возрастать до 1–2.103 копий на клетку.

При получении библиотеки генов растений и высших животных, у которых общая длина генома составляет до 3109 и более, емкость вектора часто играет решающую роль. В данном случае в качестве вектора используют ДНК фага λ . При помощи специальных методов рекомбинантные ДНК вводят прямо в фаговые головки. Еще большей емкостью обладают плазмиды– космиды (до 40 кб), у которых cos-фрагмент генома фага λ участвует в упаковке ДНК в фаговую частицу на конечной стадии развития. Для упаковки ДНК необходимо, чтобы ДНК содержала COS-участок и ее размер был примерно равным размеру генома фага. Достигнутые методы упаковки ДНК в фаговую головку при помощи космид позволяют получать библиотеки генов практически любых организмов.

Перенос генов в клетки организма-реципиента. Перенос рекомби-

нантных ДНК осуществляется путем трансформации или конъюгации . Трансформация – это процесс изменения генетических свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК. Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобретают патогенные свойства. В дальнейшем

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.1 Генетическая инженерия, принципы, возможности. Области применения биологич. агентов, полученных методами генетич. инженерии

трансформация была продемонстрирована и изучена у различных видов бактерий.

Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так называемые компетентные, клетки (способные включать чужеродную ДНК и синтезирующие особый трансформирующий белок). Компетентность клетки определяется также факторами внешней среды. Этому может способствовать обработка клеток полиэтиленгликолем или хлоридом кальция. После проникновения в клетку одна из нитей рекомбинантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком реципиентной ДНК может включиться в хромосому или внехромосомную единицу. Трансформация является наиболее универсальным способом передачи генетической информации и имеет наибольшее значение для генетических технологий.

Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при котором происходит однонаправленный перенос генетической информации от донора к реципиенту. Этот перенос находится под контролем особых конъюгативных плазмид (фактор фертильности). Перенос информации от донорской клетки в реципиентную осуществляется через специальные половые ворсинки (пили). Возможна передача информации и с помощью неконъюгативных плазмид при участии плазмид-помощниц.

Передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию в клетке фаговых частиц, называется трансфекцией . Методика применительно к бактериальным клеткам включает получение сферопластов, очистку инкубационной среды от нуклеаз и добавление очищенной фаговой ДНК (присутствие протаминсульфата повышает эффективность трансфекции). Методика применима к животным и растительным клеткам с участием специальных челночных вирусных векторов.

Скрининг и отбор рекомбинантных клеток. После переноса сконст-

руированных ДНК, как правило, лишь небольшая часть реципиентных клеток приобретает необходимый ген. Поэтому очень важный этап – идентификация клеток, несущих ген-мишень.

На первой стадии идентифицируют и отбирают клетки, несущие вектор, на основе которого осуществлен перенос ДНК. Отбор проводят по генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом маркерами служат гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик. После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости.

На второй стадии отбирают клетки, несущие вектор и ген-мишень. Для этого используют две группы методов: 1) основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов и 2) основанные на идентификации признака, кодируемого геном-мишенью. При использовании первой группы методов из клеток, предположительно содержащих нужный ген, выделяют векторную ДНК, и в ней проводится поиск участков, несущих данный ген. Далее проводят секвенирование части нуклеотидной последовательности гена.

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.1 Генетическая инженерия, принципы, возможности. Области применения биологич. агентов, полученных методами генетич. инженерии

Возможен другой метод – гибридизация выделенной из клеток ДНК с зондом (искомый ген или соответствующая ему мРНК); выделенную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с зондом. Далее определяют наличие двуцепочечных гибридных молекул ДНК. Во втором варианте возможен непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени. Применяются также селективные среды, поддерживающие рост только клеток, приобретших генмишень.

С помощью методов генетической инженерии возможно конструирование новых форм микроорганизмов по заданному плану, способных синтезировать разнообразные продукты, в том числе эукариотических организмов. Рекомбинантные микробные клетки быстро размножаются в контролируемых условиях и способны утилизировать при этом разнообразные, в том числе недорогие, субстраты.

Основные проблемы, возникающие при генетических манипуляциях, заключаются в следующем: 1) гены при трансформации, попадая в чужеродную среду, подвергаются воздействию протеаз, поэтому их надо защищать; 2) как правило, продукт трансплантированного гена аккумулируется в клетках и не выделяется в среду; 3) большинство желаемых признаков кодируется не одним, а группой генов. Все это существенно затрудняет перенос и требует разработки технологии последовательной трансплантации каждого гена.

К настоящему времени генетическая инженерия освоила все царства живого. Фенотипическое выражение «чужих» генов (экспрессия) получены у бактерий, дрожжей, грибов, растений и животных. Блестящие успехи достигнуты на клетках наиболее и всесторонне изученных микроорганизмов. Эра рекомбинантных ДНК применительно к растениям и высшим животным только начинается. В области генетической инженерии животных клониро-

ваны гены β -глобина мышей, фага λ . Помимо почечных клеток зеленой африканской мартышки, испытываются все новые виды культуры животных клеток, в том числе клетки человека. Например, в клетках непарного шелкопряда с применением вирусного вектора удалось добиться экспрессии гена β -интерферона человека. Этот ген также клонирован в клетках млекопитающих. В генетической инженерии человека, как и в генетическом конструировании растений, пока не достигнуто тканеспецифического выражения генов. Решения данной проблемы ищут на путях введения определенных промоторов регуляторных участков в конструируемые векторы. Пока остается достаточно отдаленной задачей возможность улучшения сельскохозяйственных пород животных. К настоящему времени практически нет сведений по генетике таких признаков, как плодовитость, выход и жирность молока, повышение устойчивости к болезням и др. Это препятствует попыткам генетических манипуляций в данной области.

Генетическая инженерия не только дает в руки биотехнологов новые продуценты ценных соединений, но и улучшает и повышает эффективность ценных свойств уже традиционно используемых организмов. Распространен-

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.1 Генетическая инженерия, принципы, возможности. Области применения биологич. агентов, полученных методами генетич. инженерии

ным методом повышения выхода полезного продукта является амплифика-

ция – увеличение числа копий генов. Образование многих целевых про-

дуктов (аминокислот, витаминов, антибиотиков и др.) характеризуется длинным биохимическим путем синтеза, который управляется не одним, а десятками генов. Выделение этих генов и клонирование с помощью амплификации представляет довольно трудную, но в ряде случаев возможную задачу. Повышение выхода полезного продукта достигается также с помощью лока-

лизованного (сайт-специфического) мутагенеза in vitro: с использованием химического мутагенеза обрабатывается не весь геном клетки, а его фрагмент, полученный с помощью рестрикции.

6.2 Технологиигенетическогоконструированияорганизмов in vitro. ИсточникиДНКдляклонированиягенов (рестрикция, ферментныйихимико-ферментныйсинтезгенов).

МетодывведенияДНК.. ЭкспрессиягеновврекомбинантныхДНК. Геннаяинженерияпромышленноважныхпродуцентовинсулина, соматотропина, интерферонов

Развитие техники рекомбинантных ДНК позволяет проводить выделение генов эукариот и экспрессировать их в гетерологических системах. В настоящее время методы генетической инженерии позволяют конструировать генетические системы, способные функционировать в клетках прокариот и эукариот. Эти возможности используют для создания организмов, обладающие новыми ценными свойствами, например бактериальные штаммы, способные синтезировать эукариотические белки.

Среди белковых продуктов, представляющих большой интерес, выделяются такие биологически активные вещества, как гормоны. Важное место среди них занимают белковые и пептидные гормоны. Эти гормоны, многие из которых остро необходимы в медицине, до недавнего времени получали экстракцией из тканей животных при условии, что гормон не обладает выраженной видовой специфичностью. Сравнительно короткие пептидные гормоны пытались получать химическим синтезом. Но такой путь получения оказался нерентабельным уже для молекул, состоящих из нескольких десятков звеньев. Единственным источником гормонов с крайне выраженной видовой специфичностью (гормон роста соматотропин) были органы умерших людей.

Успехи генетической инженерии вселили надежды на возможность клонирования генов синтеза ряда гормонов в микробных клетках. Эти надежды в значительной мере оправдались, в первую очередь, на примере микробиологического синтеза пептидных гормонов.

Первые успешные результаты по экспрессии химически синтезированной последовательности нуклеотидов ДНК, кодирующей 14-звенный пептидный гормон соматостатин (антагонист соматотропина), получены в 1977 году в США компанией «Генетек». Для предотвращения процесса разруше-

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

ния гормона в бактериальных клетках под воздействием пептидазы авторы применили подход, который потом был успешно использован для получения других пептидных гормонов. Был сконструирован гибридный ген, часть которого была взята из гена фермента β -галактозидазы кишечной палочки, а остаток представлял собой фрагмент, кодирующий собственно соматостатин (фрагмент синтезировали химически). Введенный в бактериальные клетки гибридный ген направлял синтез белка-химеры, состоящего более чем на 90 % из аминокислотной последовательности β -галактозидазы. Остальная часть представляла собой соматостатин. На стыке участка двух исходных генов находился кодон аминокислоты метионина. Последнее позволило обработать гибридный белок бромцианом, разрывающим пептидную связь, образованную метионином; среди продуктов расщепления был обнаружен соматостатин. Данный подход был использован для получения многих пептидных гормонов (А- и В-цепей инсулина, нейропептида лейэнкефалина, брадикинина, ангиотензина и др.).

Генноинженерными методами за короткий срок были созданы микро- организмы-суперпродуценты, позволяющие получать с высокими выходами ряд белков вирусов и животных. Созданы штаммы, у которых до 20 % клеточного белка составляют генноинженерные продукты, например коровий антиген вируса гепатита В, главный капсидный антиген вируса ящура, реннин теленка, поверхностный антиген вируса гепатита В и др.

Получение рекомбинантного инсулина. Гормон инсулин построен из двух полипептидных цепей, А и Б, длиной в 20 и 30 аминокислот соответственно. Последовательность цепей была установлена в 1955 году Сэнгером. Синтез обеих цепей, включающий 170 химических реакций, в 1963 году был реализован в США, ФРГ и Китае. Но перенести такой сложный процесс в промышленность оказалось невозможным. Получали инсулин до 1980 году за счет выделения его из поджелудочной железы (поджелудочная железа коровы весит 200–250 г, а для получения 100 г кристаллического инсулина требуется до 1 кг исходного сырья). Поэтому потребности в нем удовлетворяли не полностью. Так, в 1979 году из 6 млн. зарегистрированных больных сахарным диабетом инсулин получали только 4 млн. человек. В 1980 году датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением остатка аланина, который является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина. В результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99 %-й чистоты. В организме животного две полипептидные цепи исходно являются частями одной белковой молекулы длиной в 109 аминокислот – это препроинсулин. При синтезе в клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты служат сигналом для транспорта молекулы сквозь мембрану клетки. Эти аминокислоты отщепляются, и образуется проинсулин длиной в 86 аминокислот.

В 1980 году Гилберт с коллегами выделили мРНК инсулина из опухоли β -клеток поджелудочной железы крысы (в то времяне разрешали манипулиро-

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.2 Технологии генетического конструирования организмов nvitro. Источники ДНКдля клонирования генов. Методывведения ДНК…

вать генами человека). Полученную ДНК-копию мРНК встроили в плазмиду pBR 322, в среднюю часть гена пенициллиназы (фермент в норме выделяется из клетки), которую транспортировали в бактерию. Сконструированная плазмида, как оказалось, содержала информацию о структуре проинсулина, а не препроинсулина. При трансляции мРНК в клетках E. coli синтезировался гибридный белок, содержащий последовательности пенициллиназы и проинсулина. Гормон из этого белка выщепляли трипсином. Было доказано, что полученный таким образом белок влияет на сахарный обмен аналогично гормону поджелудочной железы. В 1979 году в США в течение трех месяцев синтезировали гены, кодирующие А- и В-цепи инсулина; гены были собраны из 18 и 11 олигонуклеотидов соответственно. Далее гены были встроены, как и при получении соматостатина, в плазмиду в конце генаβ -галактозидазы кишечной палочки.

В клетках E. coli также осуществлен синтез проинсулина, а не только его отдельных цепей. На выделенной матричной мРНК синтезировали ДНКкопию. Синтез проинсулина имеет определенные преимущества, так как процедуры экстракции и очистки гормона минимальны.

Совершенствование техники получения генноинженерных штаммовпродуцентов с помощью различных приемов (амплификацией плазмид, инкапсулированием вводимых рекомбинантных ДНК, подавлением протеолитической активности реципиентных клеток) позволило получить высокие выходы гормона, до 200 мг/л культуры. Медико-биологические и клинические испытания генноинженерного белка показали пригодность препарата, и в 1982 году он был допущен к производству во многих странах.

Биосинтез соматотропина. Соматотропин (гипофизарный гормон роста) впервые был выделен в 1963 году из трупного материала. Выход гормона из одного гипофиза составлял около 4–6 мг в пересчете на готовый фармацевтический препарат. Для лечения карликовости необходимая доза составляет 6 мг в неделю в течение года. Кроме недостатка по массе, получаемый экстракцией препарат был гетерогенным, против него вырабатывались антитела, которые сводили на нет действие гормона. Более того, существовала опасность, что при получении препарата могло произойти заражение организма медленно развивающими вирусами. Поэтому дети, получавшие данный препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Генноинженерный препарат имеет несомненные преимущества: доступен в больших количествах, гомогенен, не содержит вирусов. Синтез соматотропина, состоящего из 191 аминокислотного остатка, был осуществлен в США Гедделем с сотрудниками в 1979 году (компания «Генентек»).

При химико-ферментном синтезе ДНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, поэтому был выбран специальный путь клонирования. На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестиктазами получали последовательность, кодирующую всю аминокислотную последовательность гормона, кроме первых 23 аминокислот. Далее клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий этим 23 аминокислотам со стартовым ANG кодоном в начале. Два получен-

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.2 Технологии генетического конструирования организмов nvitro. Источники ДНКдля клонирования генов. Методывведения ДНК…

ных фрагмента соединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Сконструированный ген трансплантировали в E. coli. Синтезированный в бактериях гормон обладал требуемой молекулярной массой, не был связан с каким-либо белком; его выход составлял около 100 000 молекул на клетку. Гормон, однако, содержал на N-конце полипептидной цепи дополнительный остаток метионина; при удалении последнего выход гормона был низким.

В 1980 году были получены доказательства того, что генноинженерный соматотропин обладает биологической активностью нативного гормона. Клинические испытания препарата также прошли успешно. В 1982 году гормон был получен также на основе сконструированной кишечной палочки в Институте Пастера в Париже. Стоимость гормона к 1990 году снизилась до 5 долларов/ед. В настоящее время его начинают применять в животноводстве для стимулирования роста домашнего скота, удоев и др.

Получение интерферонов. Интерфероны – группа белков, способных продуцироваться в ядерных клетках позвоночных. Это мощные индуцибельные белки, являющиеся фактором неспецифической резистентности, поддерживающего гомеостаз организма. Система интерферонов обладает регуляторной функцией в организме, так как способна модифицировать различные биохимические процессы. Интерфероны позвоночных, в том

числе человека, разделяют на три группы: α , β , γ , соответственно, лейкоцитарные, фибробластные и иммунные.

В конце 70-х годах стала очевидной потенциальная значимость интерферонов для медицины, в том числе профилактики онкологических заболеваний. Клинические испытания сдерживались отсутствием достаточных количеств интерферонов и высокой стоимостью препаратов, полученных традиционным способом (выделение из крови). Так, в 1978 г оду для получения

0.1 г чистого интерферона в Центральной лаборатории здравоохранения Хельсинки (лаборатория – мировой лидер по производству интерферона из лейкоцитов здоровых людей) получали при переработке 50 000 л крови. Полученное количество препарата оценочно могло обеспечить лечение против вирусной инфекции 10 000 случаев. Перспективы получения интерферонов связывали с генной инженерией.

В 1980 году Гилберту и Вейссману в США удалось получить интерферон в генетически сконструированной E. coli. Исходная трудность, с которой они столкнулись, – низкий уровень мРНК в лейкоцитах, даже стимулированных заражением вирусом. При переработке 17 л крови удалось выделить мРНК и получить ДНК-копию. Последнюю встроили в плазмиду и клонировали в E. coli . Было испытано свыше 20 000 клонов. Отдельные клоны были способны к синтезу интерферона, но с низким выходом, 1–2 молекулы на клетку. Аналогичные исследования проводили в Японии, Англии, Франции, России.

В 1980 г. были установлены нуклеотидные последовательности α - и β - интерферонов: мРНК фибробластного интерферона состоит из 836 нуклеоти-

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.2 Технологии генетического конструирования организмов nvitro. Источники ДНКдля клонирования генов. Методывведения ДНК…

дов; из них 72 и 203 нуклеотида приходятся на 5’- и 3’ -нетранслируемые области, 63 кодируют пептид, ответственный за секрецию интерферона из клеток, и 498 нуклеотидов кодируют 166 аминокислотных остатков собственно интерферона. После этого химическим синтезом были получены гены α - и β - интерферонов, которые клонировали в E. coli . В 1981 г оду была расшифрована нуклеотидная последовательность иммунного интерферона, существенно отличающегося от первых двух, но сравнимого по величине молекулы. Существенным моментом был полный синтез гена лейкоцитарного интерферона человека, осуществленный в Великобритании сотрудниками фирмы «Империал кемикал индастри» и Школы биологических наук Лестерского университета. В течение полутора лет была синтезирована полная последовательность ДНК-копии интерферона, способная кодировать α 1 -интерферон. Синтез олигонуклеотидов был осуществлен новым методом, значительно ускорившим синтез гена. Вначале к полиакриламидной смоле был присоединен нуклеотид; далее проводили присоединение пар нуклеотидов, используя конденсирующий агент в безводном пиридине. Каждый цикл длился полтора часа, поэтому в течение года можно было синтезировать последовательность длиной в 5000 нуклеотидов. Было синтезировано 67 олигонуклеотидов, которые с помощью лигазы соединили в двунитевую ДНК, состоящую из 514 пар нуклеотидов. Полученный ген встраивали в клетки двух бактерий: E. coli ,

Methylophilus methylotrophus, и была получена экспрессия.

Усилия, направленные на получение генноинженерных интерферонов, по сравнению с методом культуры клеток позволили снизить затраты более чем в 100 раз. Были получены различные типы интерферонов на основе генноинженерных клеток бактерий и дрожжей. Это дало возможность развернуть медико-биологические и клинические испытания препаратов. Получаемые в течение 1980–1981 годов препараты интерферонов были очищены на 80 %-й и обладали удельной активностью более 107 международных единиц на 1 мг белка. Расширение клинических испытаний интерферонов, начатых в этот период, зависит от повышения степени его очистки. Прогресс в этом направлении был достигнут применением моноклональных антител, которые можно использовать для аффинной хроматографии (при этом нужные белки задерживаются на колонке с антителами).

6.3 Клеточнаяинженерия. Получениебиологическихагентов методамиклеточнойинженерииin vivo. Мутагенез.

Методыполученияивыделениямутантов. Гибридизацияэукариотическихклеток.

Плазмидыиконьюгацияубактерий. Фагиитрансдукция. Техникаслиянияпротопластов. Гибридомы.

Получениеиприменениемоноклональныхантител

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Традиционно для получения более активных биологических агентов при-

меняли селекцию и мутагенез. Селекция – это направленный отбор мутантов

– организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции– это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и других микроорганизмов. Ограничения метода селекции связано с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен удвоиться в среднем 106 –108 раз,чтобы возникала мутация.

К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцированный мутагенез (резкое увеличение частоты мутаций биологического объекта при искусственном повреждении генома). Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ряд химических соединений (азотистая кислота, бромурацил, антибиотики и пр.). После обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку) полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят повторную обработку отобранных клонов и вновь отбирают продуктивные клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку.

Работа эта требует больших трудозатрат и времени. Недостатки ступенчатого отбора могут быть в значительной степени преодолены при сочетании его с методами генетического обмена.

Генетическое конструирование in vivo (клеточная инженерия) включает получение и выделение мутантов и использование различных способов обмена наследственной информацией живых клеток

Основой клеточной инженерии является слияние неполовых клеток (гибридизация соматических клеток) с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным, или клетка-реципиент может приобрести отдельные части донорской клетки (митохондрии, цитоплазму, ядерный геном, хлоропласты и др.). К рекомбинации ведут различные процессы обмена генетической информацией живых клеток (половой и парасексуальный процессы эукариотических клеток; конъюгация, трансформация и трансдукция у прокариот, а также универсальный метод – слияние протопластов).

При гибридизации берут генетически маркированные штаммы микроорганизмов (чаще ауксотрофные мутанты или мутанты, устойчивые к ингибиторам роста). В результате слияния клеток (копуляции) происходит образование гибридов у дрожжей, грибов, водорослей. Если исходные клетки были гаплоидными, в результате слияния ядер появляется диплоидная клетка (зигота), несущая в ядре двойной набор хромосом. У отдельных представителей ядро сразу подвергается мейозу, в ходе которого каждая из хромосом расщепляется. Гомологичные хромосомы образуют пары и обмениваются частями своих хроматид в результате кроссинговера. Далее формируются гаплоидные половые споры, каждая из которых содержит набор генов, которыми различались родительские клетки, в результате рекомбинации генов

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.3 Клеточная инженерия. Получ. биологич. агентов методами клеточ. инженерии in vivo. Мутагенез. Методы получ. и выделения мутантов

одной и той же хромосомы, а также разных хромосом при распределении хромосомных пар. Если после слияния ядра не сливаются, образуются формы со смешенной цитоплазмой и ядрами разного происхождения (гетерокарионы). Такие формы свойственны грибам, особенно продуцентам пенициллинов. При размножении полученных гетерозиготных диплоидов или гетерокарионов происходит расщепление – проявление в потомстве, обнаруживающем не только доминантные, но и рецессивные признаки родителей. Половой и парасексуальный процессы широко используют в генетической практике промышленно важных микроорганизмов-продуцентов.

У бактерий обмен генетической информацией происходит в результате взаимодействия конъюгативных плазмид (конъюгации) . Впервые конъю-

гацию наблюдали у E. coli K-12. Для конъюгационного скрещивания культуру донора и реципиента смешивают и совместно инкубируют в питательном бульоне или на поверхности агаризованных сред. Клетки при помощи образующегося конъюгационного мостика соединяются между собой; через мостик осуществляется передача определенного сайта плазмидной хромосомы к реципиенту. Так, при 37 °С для переноса всей хромосомы требуется около 90 минут. Конъюгация открыла и открывает широкие перспективы для генетического анализа и конструирования штаммов.

Трансдукция – процесс переноса генетической информации от клетки реципиента к клетке-донору с помощью фага. Впервые этот про-

цесс был описан в 1952 году Циндером и Лидербергом. Трансдукция основана на том, что в процессе размножения фагов в бактериях возможно образование частиц, которые содержат фаговую ДНК и фрагменты бактериальной ДНК. Для осуществления трансдукции нужно размножить фаг в клетках штаммадонора, а затем заразить им клетки-реципиента. Отбор рекомбинантных форм проводят на селективных средах, не поддерживающих роста исходных форм.

В последние годы очень широко применяют метод слияния протопластов. Этот метод, видимо, является универсальным способом введения генетической информации в клетки различного происхождения. Простота метода делает его доступным для селекции промышленно важных продуцентов. Метод открывает новые возможности для получения межвидовых и межродовых гибридов и скрещивания филогенетически отдаленных форм живого. Получены положительные результаты слияния бактериальных, дрожжевых и растительных клеток. Получены межвидовые и межродовые гибриды дрожжей. Имеются данные о слиянии клеток различных видов бактерий и грибов. Удалось получить гибридные клетки в результате слияния клеток организмов, относящихся к различным царствам: животного и растительного. Ядерные клетки лягушки были слиты с протопластами моркови; гибридная растительно-животная клетка росла на средах для растительных клеток, однако быстро утрачивала ядро и покрывалась клеточной стенкой.

В последние годы успешно проводятся работы по созданию ассоциаций клеток различных организмов, то есть получают смешанные культуры клеток двух или более организмов с целью создания искусственных симбиозов. Успешно проведены опыты по введению азотфиксирующего организма

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.3 Клеточная инженерия. Получ. биологич. агентов методами клеточ. инженерии in vivo. Мутагенез. Методы получ. и выделения мутантов

Anabaena variabilis в растения табака. Попытки введения A. variabilis непосредственно в черенки зрелых растений табака не дали положительных результатов. Но при совместном культивировании мезофильной ткани табака и цианобактерий удалось получить растения-регенеранты, содержащие цианобактерии. Получены ассоциации клеток женьшеня и паслена с цианобактери-

ей Chlorogleae fritschii.

Перспективно клональное размножение животных клеток для генетических манипуляций. Большие перспективы имеет техника клеточных культур животных клеток для получения биологически активных соединений, хотя делает пока только первые шаги. Культуры опухолевых клеток или нормальные клетки, трансформированные in vitro, сохраняют в ряде случаев способность синтезировать специфические продукты. Несмотря имеющиеся трудности, показана возможность получения ряда веществ в культуре животных клеток.

Важное направление клеточной инженерии связано с ранними эмбриональными стадиями. Так, оплодотворение яйцеклеток в пробирке позволяет преодолеть бесплодие. С помощью инъекции гормонов можно получить от одного животного десятки яйцеклеток, искусственно их оплодотворить in vitro и имплантировать в матку других животных. Эта технология применяется в животноводстве для получения монозиготных близнецов. Разработан новый метод, основанный на способности индивидуальных клеток раннего эмбриона развиваться в нормальный плод. Клетки эмбриона разделяют на несколько равных частей и трансплантируют реципиентам. Это позволяет размножать различных животных ускоренным путем. Манипуляции на эмбрионах используют для создания эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овцекозлиные химеры.

Наиболее перспективным направлением клеточной инженерии являет-

ся гибридомная технология . Гибридные клетки (гибридомы) образуются в результате слияния клеток с различными генетическими программами, например, нормальных дифференцированных и трансформированных клеток. Блестящим примером достижения данной технологии служат гибридомы, полученные в результате слияния нормальных лимфоцитов и миеломных клеток. Эти гибридные клетки обладают способностью к синтезу специфических антител, а также к неограниченному росту в процессе культивирования.

В отличие от традиционной техники получения антител, гибридомная техника впервые позволила получить моноклональные антитела (антитела, продуцируемые потомками одной-единственной клетки). Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты. Возможно получение нескольких моноклональных антител на разные антигенные детерминанты, в том числе сложные макромолекулы.

Моноклональные антитела в промышленных масштабах получены сравнительно недавно. Как известно, нормальная иммунная система способна в ответ на чужеродные агенты (антигены) вырабатывать до миллиона различных видов антител, а злокачественная клетка синтезирует только антитела одного типа. Миеломные клетки быстро размножаются. Поэтому культуру, получен-

6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

6.3 Клеточная инженерия. Получ. биологич. агентов методами клеточ. инженерии in vivo. Мутагенез. Методы получ. и выделения мутантов

ную от единственной миеломной клетки, можно поддерживать очень долго. Однако невозможно заставить миеломные клетки вырабатывать антитела к определенному антигену. Эту проблему удалось решить в 1975 году Цезарю Мильштейну. У сотрудников Медицинской научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии в Кембридже возникла идея слияния клеток мышиной миеломы с В-лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной каким-либо специфическим антигеном. Образующиеся в результате слияния гибридные клетки приобретают свойства обеих родительских клеток: бессмертие и способность секретировать огромное количество какого-либо одного антитела определенного типа. Эти работы имели огромное значение и открыли новую эру в экспериментальной иммунологии.

В 1980 году в США Карло М. Кроче с сотрудниками удалось создать стабильную, продуцирующую антигены, внутривидовую человеческую гибридому путем слияния В-лимфоцитов миеломного больного с периферическими лимфоцитами от больного с подострым панэнцефалитом.

Основные этапы получения гибридомной техники следующие. Мышей иммунизируют антигеном, после этого из селезенки выделяют спленоциты, которые в присутствии полиэтиленгликоля сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектными по ферментам запасного пути биосинтеза нуклеотидов – гипоксантина или тиамина). Далее на селективной среде, позволяющей размножаться только гибридным клеткам, проводят их отбор. Питательную среду с растущими гибридомами тестируют на присутствие антител. Положительные культуры отбирают и клонируют. Клоны инъецируют животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре. Асцитная жидкость мыши может содержать до 10– 30 мг/мл моноклональных антител.

Гибридомы можно хранить в замороженном состоянии и в любое время вводить дозу такого клона в животное той линии, от которой получены клетки для слияния. В настоящее время созданы банки моноклональных антител. Антитела применяют в разнообразных диагностических и терапевтических целях, включая противораковое лечение.

Эффективным способом применения моноклональных антител в терапии является связывание их с цитоксическими ядами. Антитела, конъюгированные с ядами, отслеживают и уничтожают в макроорганизме опухолевые клетки определенной специфичности.

Таким образом, клеточная инженерия служит эффективным способом модификации биологических объектов и позволяет получать новые ценные продуценты на органном и также клеточном и тканевом уровнях.

Биотехнология - это сознательное производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов и биологических процессов.

С незапамятных времен биотехнология применялась преимущественно в пищевой и легкой промышленности: в виноделии, хлебопечении, сбраживании молочных продуктов, при обработке льна и кож, основанных на применении микроорганизмов. В последние десятилетия возможности биотехнологии необычайно расширились. Это связано с тем, что ее методы выгоднее Обычных по той простой причине, что в живых организмах биохимические реакции, катализируемые ферментами, идут при оптимальных условиях (температуре и давлении), более производительны, экологически чисты и не требуют химических реактивов, отравляющих среду.

Объектами биотехнологии являются многочисленные представители групп живых организмов - микроорганизмы (вирусы, бактерии, простейшие, дрожжевые грибы), растения, животные, а также изолированные из них клетки и субклеточные компоненты (органеллы) и даже ферменты. Биотехнология базируется на протекающих в живых системах физиолого-биохимических процессах, в результате которых осуществляются выделение энергии, синтез и расщепление продуктов метаболизма, формирование химических и структурных компонентов клетки.

Главным направлением биотехнологии является производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферменты, витамины, гормоны), лекарственных препаратов (антибиотики, вакцины, сыворотки, высокоспецифичные антитела и др.), а также ценных соединений (кормовые добавки, например, незаменимые аминокислоты, кормовые белки и т. д.). Методы генетической инженерии позволили осуществить синтез в промышленных количествах таких гормонов, как инсулин и соматотропин (гормон роста), которые необходимы для лечения генетических болезней человека.

Одним из важнейших направлений современной биотехнологии является также использование биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод, загрязненной почвы и т. п.).

Так, для извлечения металлов из сточных вод могут широко использоваться штаммы бактерий, способные накапливать уран, медь, кобальт. Другие бактерии родов Rhodococcus и Nocardia с успехом применяют для эмульгирования и сорбции углеводородов нефти из водной среды. Они способны разделять водную и нефтяную фазы, концентрировать нефть, очищать сточные воды от примесей нефти. Ассимилируя углеводороды нефти, такие микроорганизмы преобразуют их в белки, витамины из группы В и каротины.

Некоторые из штаммов галобактерий с успехом применяют для удаления мазута с песчаных пляжей. Получены также генно-инженерные штаммы, способные расщеплять октан, камфару, нафталин, ксилол, эффективно утилизировать сырую нефть.

Большое значение имеет использование методов биотехнологии для защиты растений от вредителей и болезней.

Биотехнология проникает в тяжелую промышленность, где микроорганизмы используются для добычи, превращения и переработки природных ископаемых. Уже в древности первые металлурги получали железо из болотных руд, производимых железобактериями, которые способны концентрировать железо. Теперь разработаны способы бактериальной концентрации ряда других денных металлов: марганца, цинка, меди, хрома и др. Эти методы используются для разработки отвалов старых рудников и бедных месторождений, где традиционные методы добычи экономически невыгодны.

Генетическая инженерия - один из важнейших методов биотехнологии. Она предполагает целенаправленное искусственное создание определенных комбинаций генетического материала, способных нормально функционировать в клетке, т. е. размножаться и контролировать синтез конечных продуктов. Можно выделить несколько разновидностей метода генетической инженерии в зависимости от уровня и особенностей его использования.

Генетическая инженерия используется в основном на прокариотах и микроорганизмах, хотя в последнее время начала применяться и на высших эукариотах (например, на растениях). Этот метод включает выделение из клеток отдельных генов или синтез генов вне клеток (например, на основе матричной РНК, синтезированной данным геном), направленную перестройку, копирование и размножение выделенных или синтезированных генов (клонирование генов), а также их перенос и включение в подлежащий изменению геном. Таким путем можно добиться включения в клетки бактерий «чужих» генов и синтеза бактериями важных для человека соединений. Благодаря этому в геном кишечной палочки удалось ввести ген синтеза инсулина из генома человека. Инсулин, синтезированный бактериями, используется для лечения больных сахарным диабетом.

Развитие генетической инженерии стало возможным благодаря открытию двух ферментов - рестриктаз, разрезающих молекулу ДНК в строго определенных участках, и лигаз, сшивающих кусочки различных молекул ДНК друг с другом. Кроме того, в основе генетической инженерии лежит открытие векторов, которые представляют собой короткие, самостоятельно размножающиеся в клетках бактерий кольцевые молекулы ДНК. С помощью рестриктаз и лигаз в векторы и встраивают необходимый ген, добиваясь впоследствии его включения в геном клетки-хозяина.

Клеточная инженерия - это метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции. Она базируется на использовании методов культуры клеток и тканей. Выделяются два направления клеточной инженерии: 1) использование клеток, переведенных в культуру, для синтеза различных полезных для человека соединений; 2) применение культивируемых клеток для получения из них растений-регенерантов.

Растительные клетки в культуре - это важный источник ценнейших природных веществ, так как они сохраняют способность синтезировать свойственные им вещества: алкалоиды, эфирные масла, смолы, биологически активные соединения. Так, переведенные в культуру клетки женьшеня продолжают синтезировать, как и в составе целостного растения, ценное лекарственное сырье. Причем, в культуре с клетками и их геномами можно проводить любые манипуляции. Используя индуцированный мутагенез, можно повышать продуктивность штаммов культивируемых клеток и проводить их гибридизацию (в том числе и отдаленную) гораздо легче и проще, чем на уровне целостного организма. Кроме этого, с ними, как и с прокариотическими клетками, можно проводить генно-инженерные работы.

Путем гибридизации лимфоцитов (клеток, синтезирующих антитела, но неохотно и недолго растущих в культуре) с опухолевыми клетками, обладающими потенциальным бессмертием и способными к неограниченному росту в искусственной среде, решена одна из важнейших задач биотехнологии на современном этапе - получены клетки гибридомы, способные к бесконечному синтезу высокоспецифических антител определенного типа.

Таким образом, клеточная инженерия позволяет конструировать клетки нового типа с помощью мутационного процесса, гибридизации и, более того, комбинировать отдельные фрагменты разных клеток (ядра, митохондрии, пластиды, цитоплазму, хромосомы и т. д.), клетки различных видов, относящиеся не только к разным родам, семействам, но и царствам. Это облегчает решение многих теоретических проблем и имеет практическое значение.

Клеточная инженерия широко используется в селекции растений. Выведены гибриды томата и картофеля, яблони и вишни. Регенерированные из таких клеток растения с измененной наследственностью позволяют синтезировать новые формы, сорта, обладающие полезными свойствами и устойчивые к неблагоприятным условиям среды и болезням. Этот метод широко используется и для «спасения» ценных сортов, пораженных вирусными болезнями. Из их ростков в культуре выделяют несколько верхушечных клеток, еще не пораженных вирусом, и добиваются регенерации из них здоровых растений сначала в пробирке, а затем пересаживают в почву и размножают.

Заключение

Для того чтобы обеспечить себя доброкачественной пищей и сырьем и при этом не привести планету к экологической катастрофе, человечеству необходимо научиться эффективно изменять наследственную природу живых организмов. Поэтому не случайно главной задачей селекционеров в наше время стало решение проблемы создания новых форм растений, животных и микроорганизмов, хорошо приспособленных к индустриальным способам производства, устойчиво переносящих неблагоприятные условия, эффективно использующих солнечную энергию и, что особенно важно, позволяющих получать биологически чистую продукцию без чрезмерного загрязнения окружающей среды. Принципиально новыми подходами к решению этой фундаментальной проблемы является использование в селекции генной и клеточной инженерии.

Биотехнология решает не только конкретные задачи науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача - она расширяет и ускоряет масштабы воздействия человека на живую природу и способствует адаптации живых систем к условиям существования человека, т. е. к ноосфере. Биотехнология, таким образом, выступает в роли мощного фактора антропогенной адаптивной эволюции.

У биотехнологии, генетической и клеточной инженерии многообещающие перспективы. При появлении все новых и новых векторов человек с их помощью будет внедрять нужные гены в клетки растений, животных и человека. Это позволит постепенно избавиться от многих наследственных болезней человека, заставить клетки синтезировать необходимые лекарства и биологически активные соединения, а затем - непосредственно белки и незаменимые аминокислоты, употребляемые в пищу.

Список литературы

1. Биология. / Н.П.Соколова, И.И.Андреева и др. – М.: Высшая школа, 1987. 304с.

2. Колесников С.И. Экология. – Ростов-на-Дону: Феникс, 2003. – 384с.

3. Лемеза Н.А., Камлюк Л.В., Лисов Н.Д. Биология.– М.: Айрис-пресс, 2005. 512с.

4. Петров Б.Ю. Общая биология. – СПб.: Химия, 1999. – 420с

5. Петров К.М. Взаимодействие общества и природы: Учебное пособие для вузов. - СПб: Химия, 1998. – 408с.

Приложение 1

Центры происхождения культурных растений (по Н. И. Вавилову)

Центры происхождения	Местоположение	Культурные растения
Южноазиатский тропический	Тропическая Индия, Индокитай, Южный Китай, о-ва Юго-Восточной Азии	Рис, сахарный тростник, цитрусовые, огурец, баклажаны и др. (50 % культурных растений)
Восточноазиатский	Центральный и Восточный Китай, Япония, Корея, Тайвань	Соя, просо, гречиха, плодовые и овощные культуры - слива, вишня и др. (20 % культурных растений)
Юго-Западноазиатский	Малая и Средняя Азия, Иран, Афганистан, Юго-Западная Индия	Пшеница, рожь, бобовые культуры, лен, конопля, репа, морковь, виноград, чеснок, груша, абрикос и др. (14 % культурных растений)
Средиземноморский	Страны по берегам Средиземного моря	Капуста, сахарная свекла, маслины, кормовые травы (11 % культурных растений)
Абиссинский	Абиссинское нагорье Африки	Твердая пшеница, ячмень, сорго, кофейное дерево, бананы
Центральноамериканский	Южная Мексика	Кукуруза, какао, тыква, табак, хлопчатник
Южноамериканский	Западное побережье Южной Америки	Картофель, ананас, кокаиновый куст, хинное дерево

Приложение 2

Схема менделевского скрещивания горохов пурпурноцветковых с белоцветковыми

пурпурный цветок белый цветок

черными кружками обозначены доминантные аллели; белыми - рецессивные

Приложение 3

Дигибридное скрещивание горохов, различающихся по форме и окраске семян

Приложение 4

Наследование формы гребня у кур

Петров Б.Ю. Общая биология. – СПб.: Химия, 1999. – 420с.

Биология. / Н.П.Соколова, И.И.Андреева и др. – М.: Высшая школа, 1987. – 304с.

Петров К.М. Взаимодействие общества и при­роды: Учебное пособие для вузов. - СПб: Химия, 1998. – 408с.

Колесников С.И. Экология. – Ростов-на-Дону: Феникс, 2003. – 384с.

Лемеза Н.А., Камлюк Л.В., Лисов Н.Д. Биология.– М.: Айрис-пресс, 2005.